世界上没有完全相似的两个人，其中的差异不仅体现在外观上，也体现在遗传信息的传递过程中。如何判断哪些遗传信息与外观相关？或者与某些特殊的细胞功能相关？CRISPR这种基因编辑工具在这过程中起了很大的作用，然而，这个技术在某些方面也存在一些缺陷。
　　西湖大学生命科学学院特聘研究员马丽佳，近日在Genome Biology上发表题为Direct-seq: programmed gRNA scaffold for streamlined scRNA-seq in CRISPR screen 的研究论文。前沿分享第四期，马丽佳将与大家分享他们是如何改进CRISPR基因编辑之后的单细胞RNA测序的环节。
　　

　　论文链接：
　　https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-02044-w

　　什么是CRISPR技术？

　　在生物学领域有一个重要的研究手段是遗传筛选，什么是遗传筛选？举个例子，中国人的眼睛颜色大部分是棕色，外国人的眼睛有红色或者绿色，这背后有色素沉着基因（pigmentation gene）的影响，但是除此之外，人体有很多性状我们是不知道什么基因造成的，比如说身高就是一个很复杂的性状。
　　眼睛的颜色、头发的颜色、身高、对某种疾病的易感性，这些我们叫做表型相关的遗传因素。遗传筛选就是做这样一件事情：找到跟特定表型相关的遗传因素。
　　筛选是一个高通量的过程，因为需要高效地产生大量基因突变，这在哺乳动物中很难实现，直到有了CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技术。这种新型基因编辑工具可以很好地去进行基因突变，于是出现了一种新的分支——CRISPR基因筛选或者叫CRISPR遗传筛选。CRISPR技术在基因筛选中，为改变DNA序列、基因转录和表观遗传修饰提供了新方法。
　　简单来说，CRISPR基因筛选的过程是这样的：首先准备好体外培养或体内生长的一群正常细胞，然后用CRISPR技术对细胞进行定点突变，于是每个细胞的基因型就会变得不一样，随之再施加一个筛选压力，在这种压力下很多细胞会被淘汰，最后将得到一小群细胞，这一小群细胞可能只有少量基因型（假设有10种），那么就说明这10种基因型更有可能跟我们施加的筛选压力和想要研究的表型相关。随之，生物学家们就可以利用生物技术手段来逐一检验这10种基因型。然而，从基因型到表型，中间还缺少了重要的一环，那就是细胞的基因表达谱。于是单细胞RNA测序出现了，这是一种在更高分辨率下，逐个检查每一个细胞基因表达谱的高通量实验方法。Direct-seq设计了一种方案，让单细胞测序不但识别到了每一个细胞的基因表达谱，也同时识别到了细胞的基因型。
　　利用CRISPR将1万个细胞筛选成10个细胞之后，将那10个细胞进行单细胞的RNA测序，测序之后，我们就能知道这10个对应了同一种表型的细胞，每一个细胞的基因型是什么，基因表达谱又是什么？于是基因型、基因表达谱和表型都被联系了起来，这样后续的一些生物学家就获得了更多维度的信息去深入研究那10个不一样的细胞。

兼容单细胞测序的sgRNA Scaffold改造，左边是原始的，右边为改造后

　　为什么要在单细胞层面进行RNA测序？

　　继续以前面的10个细胞举例，这10个细胞的DNA都是不一样的，但是可能最后的表型都是一样，比如都有抗药性，但是它的基因组不同，所以抗药的原因也是不一样的。在加入了一个单细胞RNA测序之后，能够帮助一些研究机制的生物学家更好地理解为什么一个细胞的基因突变会产生这样一种特异的RNA表达模式，为什么这个模式和另外细胞的模式虽然不一样，但是它们都产生了同一种表型。就像是有10条路可以通向同一个终点，但是科学家们不知道这10条路是什么样的，单细胞RNA测序就是帮助我们理解了这10条不同路径中很重要的一部分是什么样的。
　　但这不能说明RNA决定了最后的表型。中心法则表示遗传信息是从DNA到RNA到蛋白最后到细胞表型。在原来CRISPR筛选中，中间的那一环RNA水平研究是缺失的，也就是说不知道这10个基因型的RNA表达谱是什么样的。你可以想象DNA离表型最远，RNA比它稍微近一点，蛋白更近一点，这是一个相互关联、环环相扣的过程，所以必须得把中间的步骤搞清楚。
　　我们目前研究的方法主要有两个优势：一是特别简单，任何一个实验室只要会做CRISPR就会使用；二是兼容性高，单细胞RNA测序是有一些固定的实现方法，目前市面上有成熟的商业化方案，但是需要在特定的平台上操作实验，相比之下，我们的方案更加全面并且对平台没有特殊需求。
　　作为一个工具开发的论文，我们希望有更多的人能使用它，所以在论文后有一个详细的实验方案，与大家共享。
　　同时，我们也希望更多对高通量、高分辨率功能基因组学工具开发和模型应用感兴趣的同道加入实验室，一起来探索生命科学的奥秘！欢迎来信咨询（malijia@westlake.edu.cn）。