近年来，抗生素滥用成为广泛关注的社会问题之一，滥用抗生素的直接结果就是产生了大量的抗药菌，这些抗药菌的出现会使我们现有的抗生素效果变差甚至变得无效，从而给人类健康造成很大的威胁。

北京时间12月11日，《美国化学会志》（JACS）在线发表了题为“Platform to discover protease-activated antibiotics and application to siderophore-antibiotic conjugates”的研究成果。该研究成果建立了一种酶激活的前药研究方法，并将此方法用于新型抗生素的研究开发中。该文的第一作者为加州大学旧金山分校Jonathan Boyce，通讯作者为西湖大学生命科学学院特聘研究员党波波，加州大学旧金山分校William DeGrado和Ian Seiple。

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06987

为便于鉴别区分细菌，通常会利用革兰氏染色法将细菌分为两大类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，而大多数肠道菌属于革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。根据此前的研究发现，抗药菌里革兰氏阴性菌偏多，革兰氏阴性菌产生抗性的主要原因包括其外膜屏障、RND（Resistance-nodulation-cell division）外排泵蛋白，外排泵蛋白可以把细胞内的药物泵出细胞外，从而使细菌产生对抗生素的耐药性。

Albomycins是一类天然存在的对革兰氏阴性菌有效的抗生素，可以通过铁载体（siderophore）将Albomycin运送到革兰氏阴性菌的周质空间（Periplasmic space），再通过细菌周质空间内源的酶（peptidase N）剪切而释放t-RNA合成酶抑制剂去杀死细菌。受此类天然革兰氏阴性菌抗生素作用机制的启发，研究团队利用底物噬菌体展示技术鉴定了一系列可以被细菌周质空间不同内源酶剪切的多肽序列，并将这些多肽序列应用到铁载体-抗生素共轭物（siderophore-antibiotic conjugates，SACs）的设计中，从而制备广谱或者特异性的新型抗生素分子。

siderophore-antibiotic conjugates 作用机理

为了开发酶激活的铁载体-抗生素共轭物，研究人员选择直接用细菌周质空间提取物进行多肽底物筛选，在不需要鉴定酶的情况下，从而发现可以在周质空间被剪切的多肽序列。此方法也可以同时靶向周质空间不同的酶，从而降低细菌因为单一酶突变而对所开发抗生素产生抗性的风险。筛选过程中，研究人员在噬菌体上建立了完全随机化的多肽文库，再通过底物噬菌体展示技术筛选，最终经过高通量测序得到多种潜在的序列，随后经过体外实验验证得到一个可以被周质空间提取物高效剪切的序列（-WSPKYM-）。

酶激活的铁载体-抗生素共轭物开发流程

之后，研究人员利用铁载体、多肽序列-WSPKYM-、三种不同抗生素（达托霉素daptomycin, 恶唑烷酮类抗菌剂eperezolid, 索利霉素solithromycin），制备了三种不同的的铁载体-抗生素共轭物，同时，研究人员也制备了一系列对照共轭物。

• Solithromycin对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有比较好的抗菌活性。在随后的抗菌活性测试中，solithromycin conjugate的活性基本上和solithromycin相当，这说明了solithromycin conjugate确实可以在铁载体的引导下进入细菌，并在细菌周质空间里酶的介导下释放solithromycin。

• Eperezolid-NH2 对缺失外排泵的大肠杆菌（E. coli）∆bamB∆tolC没有活性(MIC >171 µM)，这可能是因为Eperezolid-NH2不能穿过细菌外膜造成的。相比较之下，Eperezolid conjugate对此细菌的抑制活性可以达到MIC = 1 µM，结合其他对照实验，这进一步证明了Eperezolid conjugate可以在铁载体的引导下进入细菌并在细菌周质空间里酶的介导下释放Eperezolid-NH2杀死细菌。

• Daptomycin本身是针对革兰氏阳性菌的抗生素，对于革兰氏阴性菌不起作用。然而，在研究中发现，当把Daptomycin制备成铁载体共轭物之后，这个共轭物对革兰氏阴性菌产生了比较强的抑制作用，而不再抑制革兰氏阳性菌。这也表明我们有可能用此方法将一些现存的抗生素的抗菌活性进行再改造，从而使其选择性发生变化。

Daptomycin-conjugate的抗菌活性测试

总结来讲，该研究开发了一种酶激活的前药研究方法，并将此方法应用到了酶激活的铁载体抗生素研究当中，去制备广谱或者精准的新型抗生素分子。该研究证明了通过此方法来开发新型抗生素是可行的，未来将会运用此方法针对不同抗药菌来发展特异性或者广谱的新型抗生素。

西湖大学党波波课题组得到浙江省结构生物学研究重点实验室、西湖实验室支持。党波波实验室致力于交叉学科研究，围绕蛋白质工程，运用蛋白质化学合成、蛋白质设计、高通量蛋白质筛选等方法开发蛋白质研究的新型技术手段，并针对蛋白靶点开发多肽、蛋白类大分子药物。实验室招收分子生物学、结构生物学、化学生物学、有机化学等相关学科的博士后、助理研究员和副研究员，欢迎加盟。简历请投递至: dangbobo@westlake.edu.cn。